Estructura, plegamiento y función de proteínas

cesos de transferencia electrónica. Se han identificado y caracterizado FNRs en cloroplastos, en bacterias, en mitocondrias de animales y de levaduras y en apicoplastos de parásitos intracelulares obligados. Participa en metabolismos tan diversos como la hidroxilación de esteroides, la reducción de nitrato, la fijación de nitrógeno e hidrógeno, la asimilación de piruvato, la desaturación de ácidos grasos, la síntesis de aminoácidos y desoxirribonucleótidos, y en la protección del estrés oxidativo en células procariotas y eucariotas. Paralelamente a esta importancia metabólica, debe mencionarse que la FNR de organismos fotosintéticos es una de las etapas limitantes del proceso y se ha convertido en modelo de una gran familia estructural de características definidas. Múltiples aspectos de estas enzimas permanecen aún desconocidos. Nuestros estudios se dirigen a comprender el mecanismo catalítico de la FNR de plantas y bacterias, y de aquellos procesos metabólicos relevantes en los que participa, con especial énfasis en las características estructurales que definen la eficiencia catalítica de estas enzimas. Específicamente estudiamos: 1) las bases estructurales que generan la alta eficiencia catalítica en las FNRs tipo plastídicas, las cuales poseen capacidades entre 100 y 200 veces mayores que sus contrapartes bacterianas, a pesar de las similitudes estructurales observadas; 2) el mecanismo molecular del proceso catalítico de estas flavoenzimas; 3) la inserción funcional de estas FNRs tipo plastídicas de alta eficiencia catalítica en el metabolismo de organismos patógenos como Leptospira interrogans, al igual que el Toxoplasma gondii y el Plasmodium falciparum, mediante el análisis estructural y funcional de esta enzima (Figura 1) y la identificación y caracterización de sus sustratos naturales. Nuestro acercamiento experimental incluye el análisis de enzimas recombinantes salvajes y modificadas por ingeniería de proteínas, tanto de plantas, de Leptospira interrogans y de bacterias (Escherichia coli y Xantomonas axonopodis). Las enzimas son estudiadas mediante análisis cinéticos, métodos biofísicos y estructurales, como así también mediante modelización de las estructuras y sus sustratos (Figura 2). También nos hemos dedicado a analizar aquellos acercamientos matemáticos que permiten evaluar la verdadera eficiencia de una enzima posibilitando así comparaciones prácticas entre diferentes formas o variantes.

2) Estudio de las relaciones estructura-función de chaperones moleculares

La importación de proteínas, la biogénesis de estructuras y la homeostasis proteica de organelas son procesos de extraordinaria importancia para la vida celular, tanto en condiciones normales como en aquellas que involucran estrés o reconversiones funcionales del tejido, como por ejemplo durante los procesos de maduración de frutos. La mayoría de las proteínas de plástidos están codificadas por genes nucleares y son sintetizadas en ribosomas citosólicos como precursores de mayor tamaño. Luego de ser importadas a la organela, sus péptidos tránsito son removidos proteolíticamente y la parte madura se pliega con la asistencia de chaperones moleculares. Por otro lado, durante los procesos de maduración de frutos, de desarrollo normal de la planta y de condiciones de estrés, ocurre una enorme reconversión proteica, especialmente en cloroplastos, en gran parte mediante proteólisis. En estos mecanismos esenciales para la vida de la planta participan chaperones moleculares. Entre estos se encuentra la familia de Hsp100/Clp, que pueden actuar tanto en forma libre o asociarse a un complejo con actividad peptidasa. Así, proteínas desnaturalizadas de forma irreversible serían reconocidas por las Hsp100 y canalizadas al complejo peptidolítico para su completa degradación. Mecanismos similares permitirían la participación de Clps en la importación de proteínas a organelas. Nuestro interés abarca el estudio de los chaperones moleculares del tipo Hsp100 de organelas de plantas a nivel estructural y funcional. Analizamos su participación en el proceso de importación de polipéptidos, en el plegamiento de proteínas y en los procesos proteolíticos en condiciones normales y de estrés. Dentro de nuestros objetivos específicos se encuentran la caracterización funcional y estructural de los chaperones ClpC1, ClpC2 y ClpD de Arabidopsis thaliana, las proteínas del complejo proteolítico ClpR2, ClpP3 y ClpP4 y las proteínas accesorias ClpT1, ClpT2 y ClpS . Estudiamos la interacción de estos chaperones con péptidos tránsito cloroplásticos salvajes y mutados, lo cual permite comprender su participación en procesos de importación de polipéptidos y degradación de precursores remanentes (Figura 3). Estos proyectos se desarrollan mediante la expresión transgénica de estas proteínas, la generación de mutantes de Arabidopsis thaliana, y estudios biofísicos y cinéticos de los chaperones puros. También se realizan experimentos de importación de polipéptidos in vitro de precursores proteicos cloroplásticos o de fusiones conteniendo GFP, a cloroplastos aislados obtenidos de plantas salvajes o de plantas deficientes en chaperones del tipo Hsp100.